活體成像研究底物之：

Firefly D-Luciferin D-蟲熒光素（Luc基因）

——活體成像研究/體外生物發(fā)光研究/轉錄水平研究

搜索關鍵詞：

Luc reporter gene 報告基因；Luciferase 螢火蟲熒光素酶；In vivo imaging 活體成像研究；熒光素酶/ATP水平研究；報告基因質粒；報告基因bing毒顆粒；螢火蟲熒光素；甲蟲熒光素；CAS：103404-75-7；

基本描述：

D-熒光素（D-Luciferin）是熒光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍用于整個生物技術領域，特別是體內活體成像技術。作用機制是在ATP和熒光素酶的作用下，D-熒光素（底物）被氧化發(fā)光。當熒光素過量時，產生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關性（見下圖）。將攜帶熒光素酶編碼基因（Luc）的質粒轉染進入細胞后，導入研究動物如大小鼠體內，之后注入熒光素，通過生物發(fā)光成像技術（BLI）來檢測光強度變化，從而實時監(jiān)測疾病發(fā)展狀態(tài)或藥物的治療功效等。也可以利用ATP對此反應體系的影響，根據(jù)生物發(fā)光強度的變化 來指示能量或生命體征。

基本應用：

1. 體內活體成像In vivo imaging；

2. 體外研究，包括熒光素酶和ATP水平分析；報告基因分析；高通量測序和各種污染檢測。

常見商業(yè)化類型的差異（熒光素鉀，鈉，游離酸）：

目前市場上常見的有三種產品形式，D-熒光素（游離酸），D-熒光素（鈉鹽），和D-熒光素（鉀鹽）。這三種產品主要差別在于溶解特性。

1）D-熒光素（游離酸）在水以及緩沖體系內的溶解性都很弱，除非溶于弱堿如NaOH和KOH溶液。溶于甲醇（10 mg/ml）和DMSO（50 mg/ml）。

2）D-熒光素（鈉鹽）和D-熒光素（鉀鹽）能夠非常容易且快速的溶入水或者緩沖液中，使用方便，溶劑無毒性，特別適合體內實驗。配成溶液后的三種產品，在絕大多數(shù)應用上都沒有實質性的差別。

3）D-熒光素（鈉鹽）和D-熒光素（鉀鹽）基本上沒有差別，主要是使用習慣等因素影響。整體來看，鉀鹽的應用文獻明顯多于鈉鹽。

使用方法【體內成像/腹腔注射】

由于D-熒光素進入體內的生物分布非?？焖偾覄恿W具組織依賴性，因此，研究人員需正式實驗前確定自身動物在D-熒光素注射后的成像采集zuijia時間。通過建立動物模型的熒光素酶動力學曲線來完成。

一．動力學曲線建立（Kinetic curve）

1.1 如下腹腔注射（i.p.）D-熒光素。傾向于注射清醒小鼠，如果需要在注射前麻醉小鼠，也是可以的，但可能會稍微延長動力學（熒光素酶表達峰值時間點）。

1.2 等待三分鐘，然后按照自身選擇的方法如氣體麻醉或注射麻醉。

1.3 將麻醉動物置于成像腔內，D-luciferin注射約5min后拍*張照片。

1.4 每隔5-10min采集圖像zui高40min，建立模型相關的熒光素酶表達動力曲線。使用2%異氟烷的麻醉健康動物能在活體成像系統(tǒng)如IVIS內安全放置45min。

1.5 一旦建立曲線后能確定zuijia的信號采集點。大部分的模型都是在D-熒光素注射10-20min后采集圖像。

二．D-熒光素溶液準備

2.1 用無菌的PBS（w/o Mg²⁺）或者DPBS（w/o Mg²⁺）配制D-熒光素（鈉鹽/鉀鹽）儲存液（15mg/ml，根據(jù)動物體重和單次注射體積來決定），0.2µm濾膜過濾除菌?；靹蚝罅⒓词褂没蚍盅b于-20℃或-80℃凍存，避免反復凍融。一旦使用，放到4℃解凍，保持冰冷且避光。

2.2 注射150mg/kg體重。（比如，體重10g小鼠注射100μl 15mg/ml的儲存液從而給1.5mg D-熒光素）；

2.3 于成像前5-15min腹腔注射D-熒光素。

【注意】：對每只動物模型需要建立D-熒光素動力學曲線研究，以確定熒光素注射后達到信號峰值的時間點。

三．腹腔注射（i.p.）

應用示例【生物化學發(fā)光體內成像】

Fig. 1 Image illustrates the IVIS spectrum imager and a mouse placed inside the camera box.

Fig. 2 Bioluminescence in vivo imaging. A. Representative luciferase time course (every 2 min) imaging of mice bearing subcutaneous tumors injected with luciferin. B. Graph illustrates the bioluminescence saturation of the whole mouse (displayed in A.) obtained

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